Kaip patikrinti gliukorafanino kiekį brokolių sėklų ekstrakte: laboratorinis tyrimas 101

Jūs įsigijote partijąbrokolių sėklų ekstraktas. Tiekėjo COA nurodyta 13 % gliukorafanino. Kaina atrodo teisinga. Dokumentacija atrodo tvarkinga. Tačiau štai klausimas, kuris atskiria patyrusius formuluotojus nuo brangiai kainuojančių klaidų: ar tikrai žinote, kaip patikrinti šį skaičių?

Gliukorafanino kiekis yra vienintelis svarbiausias kokybės žymuobrokolių sėklų ekstraktas. Jis nustato biologinį prieinamumą, klinikinę reikšmę ir etiketės teiginio tinkamumą. Tačiau jai išmatuoti naudojami analizės metodai labai skiriasi – ir ne visi jie pateikia vienodą atsakymą.

Šiame vadove tiksliai paaiškinama, ką reikia žinoti: kurie bandymo metodai yra patikimi, kurie ne, ką reiškia skaičiai ir kaip naudoti laboratorijos duomenis tiekėjui kvalifikuoti arba diskvalifikuoti.

Kodėl gliukorafanino patvirtinimas yra svarbesnis, nei manote

Gliukorafanas yra stabilus gliukozinolato pirmtakas, kuris organizme virsta sulforafanu – aktyviu Nrf2 kelio aktyvatoriumi. Be patvirtinto gliukorafano kiekio negalite numatyti sulforafano derliaus, negalite pagrįsti etiketėje nurodytų teiginių ir negalite apginti savo produkto trečiosios šalies audito metu.

Problema yra reali ir plačiai paplitusi. 2020 m. atlikta nepriklausoma komercinių sulforafano ir brokolių ekstrakto papildų analizė parodė, kad daugelyje produktų buvo daug mažiau sulforafano, nei teigiama jų etiketėse. Daugeliu atvejų pagrindinė priežastis yra netinkamas gliukorafanino patikrinimas žaliavinės sudedamosios dalies etape.

Štai kiek jums kainuoja netikslūs duomenys apie gliukorafaniną:

• Nepakankamai dozuoti gatavi produktai, kurių trečiosios šalies bandymai neatlieka
• Atsakomybė dėl reikalavimo dėl etiketės reguliuojamose rinkose (FDA, EU Cosmetics, Health Canada)
• Klientų skundai ir grąžos normos, mažinančios prekės ženklo nuosavybę
• Reguliavimo veiksmų rizika rinkose su privalomu sudedamųjų dalių pagrindimu

Geros naujienos: gliukorafaninas yra viena iš labiausiai analitiškai apdorojamų botaninių veikliųjų medžiagų papildų pramonėje. Yra patvirtinti, atkuriami bandymo metodai. Jums tereikia žinoti, kuriais pasitikėti.

Auksinis standartas: HPLC pagrįsta gliukozinolato analizė

Didelio efektyvumo skysčių chromatografija (HPLC) yra galutinis analitinis gliukorafanino kiekybinio nustatymo metodas.brokolių sėklų ekstraktas. Tai metodas, nurodytas ISO 9167-1, skirtas gliukozinolato analizei Brassica pasėliuose – ir tai vienintelis metodas, suteikiantis konkrečių junginių kiekybiškai pagrįstus duomenis.

Kaip veikia HPLC metodas

Patvirtinta gliukorafanino HPLC procedūra atliekama pagal apibrėžtą seką:

1 - veiksmas Ekstrahavimas Gliukozinolatai ekstrahuojami iš džiovintų ekstrakto miltelių naudojant karšto vandens arba metanolio-vandens tirpiklių sistemas. Paskelbti tyrimai patvirtina, kad ekstrahuojant karštu vandeniu 70–80 laipsnių temperatūroje 10–20 minučių, iš brokolių sėklų medžiagos gaunamas nuoseklus gliukorafaninas.

2 - žingsnis Desulfatacija (nepažeisto gliukozinolato analizei) Neapdoroti ekstraktai perleidžiami per DEAE-Sephadex jonų mainų kolonėles, kad būtų atskirti nepažeisti gliukozinolatai. Fermentinis desulfatavimo etapas, naudojant sulfatazę, paverčia nepažeistus gliukozinolatus į desulfo formas, kurios yra geriau aptinkamos UV spinduliuose ir geriau atskiriamos atvirkštinės fazės HPLC kolonėlėse.

3 - veiksmas Chromatografinis atskyrimas Desulfo-gliukozinolatai atskiriami C18 atvirkštinės fazės kolonėlėje, naudojant gradiento judriąją fazę (paprastai acetonitrilą/vanduo). Gliukorafaninas išsiskiria būdingu sulaikymo laiku, kuris išskiria jį iš kitų gliukozinolatų, įskaitant sinigriną, gliukonapiną ir gliukobrasiciną.

4 - veiksmas. Aptikimas ir kiekybinis nustatymas UV aptikimas esant 229 nm suteikia desulfogliukozinolatų sugerties signalą. Gliukorafanino kiekis nustatomas pagal sertifikuotą etaloninį standartą – sinigriną (kaip vidinį etaloną) arba išgrynintą gliukorafanino etaloninę medžiagą.

Ką turėtų parodyti patikima HPLC ataskaita:

• Chromatograma su aiškiai išsiskiriančia gliukorafanino smaile
• Sertifikuotą atskaitos standartą atitinkantis sulaikymo laikas (±0,1 min.)
• Smailės plotas ir apskaičiuota koncentracija mg/g arba % m/m
• Kartu išsiskiriančių gliukozinolatų (sinigrino, gliukonapino ir kt.) identifikavimas
• Nuoroda į standartinį partijos numerį ir sertifikavimo datą
• Metodo patvirtinimo parametrai (tiesiškumas, tikslumas, atkūrimas)

Kodėl kolorimetrinių tyrimų neužtenka

Daugelis tiekėjų praneša apie gliukozinolato kiekį naudodami kolorimetrinius tyrimus – ypač Kore metodą arba fermentine hidrolize pagrįstus gliukozės išsiskyrimo tyrimus. Šie metodai yra greitesni ir pigesni nei HPLC. Jie taip pat iš esmės yra netinkami gliukorafanino kiekiui nustatyti.

Čia yra pagrindinė problema:

• Kolorimetriniais gliukozinolato tyrimais matuojamas bendras gliukozinolatų kiekis, o ne konkrečiai gliukorafaninas
• Brokolių sėklų ekstraktasJame yra daug gliukozinolatų, išskyrus gliukorafaniną
• Didelis bendras gliukozinolato rodmuo gali užmaskuoti mažą gliukorafanino kiekį, jei vyrauja kiti gliukozinolatai
• Kolorimetriniai metodai negali atskirti gliukorafanino nuo sinigrino, gliukonapino ar gliukobrasicino

Praktinis scenarijus: tiekėjas praneša apie 15 % viso gliukozinolatų kolorimetriniu tyrimu. Jei tik 40 % šios frakcijos yra gliukorafaninas, tikrasis gliukorafanino kiekis yra 6 % – mažiau nei pusė numanomos vertės. Be HPLC negalite žinoti skirtumo.

Paskelbti patvirtinimo tyrimai patvirtina, kad HPLC su desulfatacija suteikia žymiai didesnį individualaus gliukozinolato kiekybinio nustatymo specifiškumą ir tikslumą nei kolorimetriniai metodai.

Esmė: priimkite kolorimetrinius duomenis tik kaip atrankos įrankį. Reikalauti HPLC kiekybinio nustatymo bet kokiam gliukorafanino specifikacijos tvirtinimui COA.

Alternatyvūs ir papildomi bandymo metodai

HPLC yra pagrindinis standartas, tačiau keli papildomi metodai suteikia pridėtinės vertės tam tikrose situacijose:

LC-MS/MS (skysčių chromatografija – tandeminė masės spektrometrija)

LC-MS/MS suteikia aukščiausią bet kurio gliukorafanino tyrimo metodo specifiškumą. Jis sujungia chromatografinį atskyrimą su masės pagrindu molekuliniu identifikavimu – pašalina bet kokius neaiškumus dėl smailių tapatumo. Jis ypač vertingas:

• Aptikti klastojimą su sintetiniu gliukorafaninu
• Gliukozinolato priemaišų pėdsakų kiekybinis nustatymas
• Gliukorafanino tapatumo patvirtinimas naujose arba sudėtingose ​​ekstraktų matricose

LC-MS/MS yra brangesnis nei standartinis HPLC ir reikalauja specializuotų prietaisų. Tai yra pasirinkimo metodas didelės vertės farmacinio lygio programoms ir ginčų sprendimo bandymams.

Micelinė elektrokinetinė kapiliarinė chromatografija (MECC)

„ResearchGate“ paskelbtas tyrimas patvirtino MECC metodą gliukorafanino nustatymui brokolių sėklose ir žiedynuose, naudojant kietosios fazės ekstrakciją. MECC siūlo gerą gliukozinolato atskyrimo skiriamąją gebą ir yra naudojamas kai kuriose specializuotose tyrimų laboratorijose. Jis yra mažiau paplitęs komercinėje QC aplinkoje nei HPLC.

Infraraudonųjų spindulių spektroskopija (NIR)

NIR yra greitas, neardomasis atrankos metodas, naudojamas tikrinant gaunamą medžiagą. Jis gali greitai ir be mėginio paruošti didelį ekstrakto sudėties klastojimą arba partijos nenuoseklumą. Tačiau NIR negali pakeisti HPLC kiekybinei gliukorafanino specifikacijai – jį reikia kalibruoti pagal HPLC patikrintus etaloninius mėginius, o mažos koncentracijos analitės tikslumas prarandamas.

In vitro konversijos tyrimas (mirozinazės hidrolizė)

Šis funkcinis testas nustato, kiek sulforafano iš tikrųjų susidaro jūsų ekstraktas imituotomis virškinimo sąlygomis. Procedūra:

• Inkubuoja ekstraktą su fermentu mirozinaze esant fiziologiniam pH ir temperatūrai
• Sulforafano išeiga matuojama HPLC metodu po nustatytų hidrolizės laikotarpių
• Rezultatai išreiškiami sulforafano ekvivalentu vienam gramui ekstrakto

Gerai apibūdintas gliukorafanino ekstraktas su aktyvia mirozinaze turėtų pasiekti 55–70% molinę konversiją į sulforafaną optimizuotomis in vitro sąlygomis. Šie duomenys labiau nuspėja biologinį prieinamumą in vivo nei vien gliukorafanino kiekis – būtent tokių duomenų vis dažniau reikalauja sudėtingi formuluotojai kartu su standartiniais COA dokumentais.

COA skaitymas: ką iš tikrųjų reiškia skaičiai

Analizės sertifikatas yra naudingas tik tiek, kiek gebate jį kritiškai interpretuoti. Štai ko ieškoti ir ko paklausti:

Gliukorafanino specifikacija – pagrindiniai parametrai:

Konkretūs skaičiai, su kuriais reikia palyginti:

• Aukštos kokybėsbrokolių sėklų ekstraktas: 10–20 % gliukorafanino pagal HPLC (sausoji masė)
• Paskelbtuose tyrimuose teigiama, kad elitiniuose brokolių genotipuose gliukorafanino koncentracija iki 274,1 µmol/g sausos masės
• Standartizuotos sulforafano rūšys: paprastai 0,1–10 % sulforafano pagal HPLC
• Mirozinazei aktyvios klasės: konversijos greitis Didesnis arba lygus 55 % standartinėmis in vitro sąlygomis

Epitiospecifinio baltymo (ESP) problema – ko nepastebi dauguma COA

Čia yra kokybės parametras, į kurį dauguma COA neatsižvelgia ir kuris gali tyliai pakenkti jūsų formulės veiksmingumui.

Epitiospecifinis baltymas (ESP) yra fermentas, natūraliai esantis brokolių sėklų medžiagoje. Kai ESP yra aktyvus, jis nukreipia gliukorafano hidrolizę nuo sulforafano link sulforafano nitrilo – junginio, neturinčio dokumentuoto Nrf2 aktyvumo.

Pasekmė: ekstraktas, kuriame yra daug gliukorafanino, bet aktyvus ESP, gali duoti žymiai mažesnę sulforafano išeigą, nei nurodyta jo specifikacijoje.

Kaip aptikti ESP trikdžius:

• Prašyti in vitro konversijos tyrimo duomenų, lyginant sulforafano išeigą su pridėta mirozinaze ir be jos
• Didelis neatitikimas tarp teorinės sulforafano išeigos (nuo gliukorafano kiekio) ir faktinio išmatuoto išeiga rodo ESP aktyvumą
• Kai kurie tiekėjai savo gamybos procese konkrečiai dokumentuoja ESP inaktyvavimą – tai reikšmingas kokybės skirtumas

Tiesiogiai paklauskite savo tiekėjo: "Ar ESP veikla buvo apibūdinta ir kontroliuojama šiame ištraukoje?" Tiekėjas, kuris negali atsakyti į šį klausimą, nevykdo farmacijos kokybės standartų.

Trečiosios šalies laboratorijos patvirtinimas – jūsų neaptartas saugos tinklas

Net ir turint švarų tiekėjo COA, nepriklausomas trečiosios šalies patvirtinimas yra būtinas bet kokiam komerciniam priedui paleisti.

Kada naudoti trečiosios šalies testavimą:

• Prieš įsipareigodami vykdyti didelį pirkimo užsakymą (patikrinimas prieš išsiuntimą)
• Keičiant tiekėjus arba gaunant naują produkcijos partiją
• Kai jūsų vidinis stabilumo tyrimas rodo netikėtą potencijos sumažėjimą
• Rengdamasis teisės aktų teikimui arba mažmeninių pirkėjų auditams

Akredituotos gliukozinolato tyrimų laboratorijos:

Ieškokite ISO/IEC 17025 akredituotų laboratorijų, turinčių dokumentuotą gliukozinolato analizės patirtį. Pagrindinės laboratorijos su paskelbta gliukozinolato metodika yra Eurofins, SGS ir NSF International. Paprašykite, kad laboratorija naudotų ISO 9167-1 pritaikytą HPLC metodą arba lygiavertę patvirtintą procedūrą – ne patentuotą kolorimetrinį ekraną.

Ką siųsti trečiosios šalies testavimui:

• Reprezentatyvus mėginys iš gamybos partijos (mažiausiai 50 g)
• Jūsų tiekėjo tos pačios partijos COA
• Specifikacijų lapas su tiksliniu gliukorafanino diapazonu
• Prašymas dėl viso gliukozinolato profilio – ne tik gliukorafanino

Priimtinas tiekėjo COA ir trečiosios šalies rezultatų skirtumas:

Pramonės praktika priima ± 5 % santykinę dispersiją, skirtą HPLC pagrįsto gliukorafanino kiekybiniam nustatymui tarp laboratorijų, naudojant tą patį patvirtintą metodą. Skirtumas, viršijantis ±10 %, reikalauja tyrimo ir tiekėjų dialogo.

Brokolių sėklų ekstrakto tiekėjo kvalifikacijos kontrolinis sąrašas

Analitinis patikrinimas nevyksta atskirai – tai platesnio tiekėjo kvalifikacijos proceso dalis. Čia yra visas kontrolinis sąrašas:

Reikalavimai dokumentacijai:

✅ COA su HPLC gliukorafanino tyrimu ir visa chromatograma

✅ Metodo patvirtinimo ataskaita (tiesiškumas, tikslumas, tikslumas, LOD/LOQ)

✅ In vitro konversijos tyrimo duomenys (sulforafano išeiga imituojant virškinimą)

✅ ESP veiklos apibūdinimo arba inaktyvavimo dokumentacija

✅ Pesticidų likučių ataskaita (GC/LC-MS, EU 396/2005 arba lygiavertis)

✅ Sunkiųjų metalų plokštė (ICP-MS)

✅ Likučio tirpiklio ataskaita (atitinka ICH Q3C)

✅ Mikrobų surašymas ir patogeno nebuvimas

✅ Pagreitinti stabilumo duomenys (gliukorafanino sulaikymas esant 37 laipsniams / 75 % santykinis drėgnis, 90 dienų)

Sertifikavimo reikalavimai:

✅ GMP sertifikatas (FDA ekvivalentas arba ES GMP)

✅ ISO 9001:2015

✅ RVASVT

✅ Ne GMO deklaracija

✅ Alergeno pranešimas

Patirties rodikliai:

Paskelbtas konkrečios ekstrakto medžiagos klinikinis tyrimas

Recenzentų analizės metodų citatos

Ilgametė tiekimo istorija su įvardytais nutraceutical prekės ženklo klientais

Viską sujungti – praktinis patikrinimo protokolas

Čia yra žingsnis po žingsnio patvirtinimo protokolas, kurį galite nedelsiant įdiegti bet kokiam gaunamam pranešimuibrokolių sėklų ekstraktaspartija:

Gavus COA iš tiekėjo:

1. Patvirtinkite, kad tyrimo metodas yra HPLC – ne kolorimetrinis
2. Patikrinkite, ar gliukorafaninas yra konkrečiai – ne kaip bendras gliukozinolatų kiekis
3. Patikrinkite, ar chromatogramoje yra pažymėta gliukorafanino smailė
4. Patvirtinkite, kad atskaitos standartas yra pavadintas ir sertifikuotas
5. Atkreipkite dėmesį į drėgmės kiekį – patikrinkite, ar tyrimas atliekamas pagal sausos masės pagrindą

Prieš pirkimo užsakymo įsipareigojimą:

1. Prašyti in vitro konversijos tyrimo duomenų
2. Paklauskite konkrečiai apie ESP apibūdinimą
3. Pateikite užklausą dėl pagreitinto stabilumo duomenų konkrečios partijos klasės
4. Patvirtinkite, kad yra pesticidų likučių ir sunkiųjų metalų ataskaitos

Gavus masinę medžiagą:

1. Siųskite tipinį pavyzdį į ISO 17025 akredituotą trečiosios šalies laboratoriją
2. Prašyti viso gliukozinolato profilio – ne tik gliukorafanino
3. Palyginkite trečiųjų šalių rezultatus su tiekėjo COA (priimtinas skirtumas ±5 %)
4. Dokumentuokite gaunamos medžiagos kokybės kontrolės įrašus

Šis protokolas užtrunka trumpiau nei sugedusio produkto performulavimas. Tai kainuoja tik dalį reguliavimo veiksmo. Ir tai yra skirtumas tarp papildo, kuris patenkina savo reikalavimus, ir to, kuris tyliai nuvilia.

Šaltinis brokolių sėklų ekstraktas su visišku analitiniu skaidrumu

Jiuyuan Bio tiekia HPLC patikrintą brokolių sėklų ekstraktą, kurio specifikacijos yra įvairios, įskaitant gliukorafaniną 10–20%, sulforafaną 0,1–10% ir mirozinazės aktyvių derinių rūšis, su visais analitiniais dokumentais kiekvienai partijai.

Kiekviena partija siunčiama su:

• HPLC chromatograma su gliukorafanino smailės identifikavimu
• In vitro konversijos tyrimo duomenys
• Visas gliukozinolato profilis
• Pranešimai apie pesticidų likučius ir sunkiuosius metalus
• Paspartinti stabilumo duomenys pagal užsakymą

👉 Peržiūrėkite visas produkto specifikacijas: https://www.jiuyuanbio.com/standard-plant-extract-powder/broccoli-seed-extract.html

📧 Dėl pavyzdžių ir analitinės dokumentacijos susisiekite su mūsų technine komanda:info@jiuybiotech.com

Dirbame su papildų kūrėjais, sutarčių gamintojais ir pirkimų komandomis visoje Šiaurės Amerikoje, Europoje ir Azijos ir Ramiojo vandenyno regione, kuriems reikia analitinio patikrinimo.brokolių sėklų ekstraktasjie gali pasitikėti.

Nuorodos

1. Berhow, MA, Polat, U., Glinski, JA, Glinski, V., Vaughn, SF ir Isbell, T. (2013). Gliukozinolatų kiekybinis nustatymas ir chemometrinė analizė Brassica rūšių sėklose. Fitocheminė analizė, 24(5), 495–503.
2. Fahey, JW, Zalcmann, AT ir Talalay, P. (2001). Gliukozinolatų ir izotiocianatų cheminė įvairovė ir pasiskirstymas tarp augalų. Fitochemija, 56(1), 5–51.
3. Velasco, P., Soengas, P., Vilar, M., Cartea, ME ir del Rio, M. (2008). Gliukozinolato profilių palyginimas skirtingų Brassica napus pasėlių lapų ir sėklų audiniuose. Amerikos sodininkystės mokslo draugijos žurnalas, 133(4), 551–558.
4. Grosser, K. ir van Dam, NM (2017). Paprastas gliukozinolato ekstrahavimo ir analizės metodas naudojant aukšto slėgio skysčių chromatografiją (HPLC). Vizualizuotų eksperimentų žurnalas, (121), e55425.
5. Dinkova-Kostova, AT ir Kostov, RV (2012). Gliukozinolatai ir izotiocianatai sveikatai ir ligoms. Trends in Molecular Medicine, 18(6), 337–347.
6. Hanschen, FS, Lamy, E., Schreiner, M. ir Rohn, S. (2014). Gliukozinolatų ir jų skilimo produktų reaktyvumas ir stabilumas maisto produktuose. Angewandte Chemie International Edition, 53(43), 11430–11450.