Brokolių sėklų ekstrakto standartizavimas: HPLC bandymas ir kolorimetrinis tyrimas

Kai pateikiate šaltinįbrokolių sėklų ekstraktasPriedo, funkcinio maisto ar maistinės formulės atveju skaičius specifikacijų lape pasakoja tik dalį istorijos. Kita dalis – dalis, apie kurią dauguma pirkėjų niekada neklausia – yra tai, kaip šis skaičius buvo sugeneruotas. Du tiekėjai gali teigti, kad „10% sulforafano“. Bet jei vienas naudoja HPLC, o kitas – kolorimetrinį tyrimą, šie du skaičiai nėra tas pats dalykas. Net ne arti.

Šis skirtumas yra labai svarbus B2B ingredientų tiekimui. Tikrinimo metodas, kurį naudoja jūsų tiekėjas, nustato, ar jūsų etiketės tvirtinimai atitinka trečiosios šalies auditą, ar jūsų gatavas produktas užtikrina biologinį aktyvumą, kurio tikisi jūsų klientai, ir ar jūs praeinate reguliavimo patikrinimą tokiose rinkose kaip JAV, ES ar Japonija.

Štai aiškus, praktiškas abiejų metodų suskirstymas – ir ką skirtumas reiškia jūsų verslui.

Ką iš tikrųjų reiškia „standartavimas“ botaniniuose ekstraktuose

Standartizavimas – tai procesas, kuriuo tikrinama, ar botaniniame ekstrakte yra apibrėžta, nuosekli vieno ar daugiau veikliųjų junginių koncentracija. Užbrokolių sėklų ekstraktas, du pagrindiniai dominantys junginiai yra:

Gliukorafanas – stabilus gliukozinolato pirmtakas, kurio natūraliai gausu brokolių sėklose

Sulforafanas – biologiškai aktyvus izotiocianatas, susidarantis gliukorafaninui reaguojant su fermentu mirozinaze

Standartizuotas ekstraktas turi deklaruojamą stiprumą, pvz., "Gliukorafanas didesnis nei 13% arba lygus 13%" arba "Sulforafanas, didesnis arba lygus 1%" - kuris turėtų būti patikrinamas, atkuriamas ir pagrįstas atliekant nepriklausomą analizę.

Problema ta, kad „standartizuotas“ automatiškai nereiškia „tiksliai išmatuotas“. Analitinis metodas, naudojamas šiai deklaruotai vertei generuoti, lemia jos patikimumą.

Kaip veikia HPLC testavimas ir kodėl jis nustato etaloną

HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) atskiria atskirus cheminius junginius mėginyje, leisdama juos per stacionarią fazę aukštu slėgiu. Kiekvienas junginys eliuuoja tam tikru būdingu sulaikymo laiku. Suporuotas su UV aptikimu arba masės spektrometrija (LC-MS/MS), HPLC identifikuoja ir kiekybiškai nustato junginius su specifiniu junginio tikslumu.

Užbrokolių sėklų ekstraktas, patvirtintas HPLC metodas veikia taip:

1. Ekstrakto mėginys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje (paprastai metanolyje arba acetonitrile/vandenyje)
2. Tirpalas praeina per atvirkštinės fazės C18 kolonėlę kontroliuojamu slėgiu
3. Gliukorafanas ir sulforafanas išsiskiria skirtingu, atkuriamu sulaikymo laiku
4. Pikų plotai apskaičiuojami pagal sertifikuotus etaloninius standartus – grynus, autentiškus junginius, kurių koncentracija yra žinoma
5. Rezultatas yra junginiui būdinga kiekybinė stiprumo vertė

Peržiūrėtas sulforafano kiekybinio nustatymo HPLC patvirtinimo metodas, paskelbtas Food Chemistry, patvirtino, kad HPLC su UV aptikimu esant 254 nm suteikia tiesinius, tikslius ir atkuriamus rezultatus plačiame koncentracijų diapazone. Metodas parodė puikų tikslumą, kai santykinio standartinio nuokrypio (RSD) reikšmės buvo mažesnės nei 2%, todėl jis tinkamas kokybės kontrolei komercinėje ekstraktų gamyboje.

Pagrindinės HPLC stiprybės brokolių ekstrakto tyrimams:

• Specifiniai junginiai – matuoja gliukorafaną ir sulforafaną atskirai, o ne mišrų signalą
• Patvirtinti ir recenzuoti – metodai yra publikuojami ir atkuriami nepriklausomai
• Etaloninis standartas – rezultatai susieti su sertifikuotais grynais junginiais, o ne su prielaidomis
• Patikimas auditas – patvirtintas FDA, ES reguliavimo institucijų ir trečiųjų šalių laboratorijų
• Jautrus – labai tiksliai nustato stiprumą esant mažoms koncentracijoms

Kaip veikia kolorimetriniai tyrimai ir kur jie neatitinka

Kolorimetriniai tyrimai (taip pat vadinami spektrofotometriniais arba UV-Vis tyrimais) matuoja spalvos reakcijos tarp mėginio ir cheminio reagento intensyvumą. Spalvos gylis, išmatuotas kaip absorbcija esant tam tikram bangos ilgiui, koreliuoja su apskaičiuota tikslinės junginių klasės koncentracija.

Gliukozinolato analizei plačiausiai naudojamas kolorimetrinis metodas yra paladžio chlorido metodas arba Sinigrino ekvivalento metodas. Mėginys reaguoja su reagentu, o gauta absorbcija lyginama su standartine kreive – dažnai sudaryta iš sinigrino, gliukozinolato, esančio garstyčiose, o ne iš paties gliukorafanino.

Čia prasideda tikslumo problema:

• Nespecifinis signalas – kolorimetriniai reagentai reaguoja su visa gliukozinolato klase, o ne tik su gliukorafaninu. Skilimo produktai, trukdantys fenoliai ir kiti augalų matricos junginiai prisideda prie absorbcijos rodmens.
• Neteisingas atskaitos standartas – naudojant sinigriną kaip gliukorafanino tarpinį serverį, atsiranda sisteminė kalibravimo klaida. Sinigrinas ir gliukorafaninas turi skirtingą molekulinę masę ir skirtingą molinę absorbciją.
• Matricos trukdžiai – brokolių sėklų ekstraktuose yra chlorofilo darinių, flavonoidų ir kitų UV spindulius sugeriančių junginių, kurie padidina absorbcijos rodmenis.
• Jokio junginio atskyrimo – skirtingai nei HPLC, kolorimetriniai metodai negali atskirti nepažeisto gliukorafanino ir jo skilimo produktų. Suskaidytas, mažo stiprumo ekstraktas gali išgauti tokį pat spalvos intensyvumą kaip ir šviežias, labai stiprus.

Praktinė pasekmė – sistemingas pervertinimas. Abrokolių sėklų ekstraktasKolorimetriniu tyrimu deklaruotas „13 % gliukorafanino“, pakartotinai tiriant HPLC, gali būti žymiai mažiau faktinio gliukorafanino. Paskelbtais lyginamaisiais gliukozinolato analizės tyrimais nustatyta, kad kolorimetriniai metodai gali pervertinti gliukozinolato kiekį 20–40 %, palyginti su chromatografiniais metodais, priklausomai nuo matricos sudėtingumo.

Gretutinis palyginimas: HPLC ir kolorimetrinis tyrimas

Čia yra tiesioginis abiejų metodų palyginimas pagal kriterijus, kurie yra svarbiausi B2B ingredientų tiekimui:

Sąnaudų skirtumas realus – HPLC įranga ir kvalifikuoti operatoriai kainuoja daugiau nei UV spektrofotometras. Tačiau būtent dėl ​​šio kainų skirtumo kai kurie tiekėjai pasirenka kolorimetrinius metodus. Tai yra sąnaudų mažinimo sprendimas, perkeliantis riziką tiesiai jums, pirkėjui.

Kodėl tai svarbu jūsų teiginiams dėl etiketės ir teisės aktų laikymosi

Jei parduodate gatavus gaminius Jungtinėse Amerikos Valstijose, etiketės teiginiai turi būti pagrįsti. FDA maisto papildų taisyklėse (21 CFR 111 dalis) reikalaujama, kad gatavo produkto specifikacijos būtų patikrintos atliekant atitinkamus bandymus. Deklaruoto aktyvaus junginio, pvz., sulforafano ar gliukorafanino, „tinkamas tyrimas“ reiškia junginiui būdingus analizės metodus – tai reiškia HPLC.

Jei jūsų žaliavos COA buvo sukurtas kolorimetriniu tyrimu, o jūsų deklaruotas stiprumas yra 30 % per didelis, jūsų galutinis produktas neatliks nepriklausomo trečiosios šalies bandymo. Toks gedimas gali sukelti:

• FDA įspėjimo laiškai dėl netinkamo prekės ženklo produktų
• Mažmenininko pašalinimas iš sąrašo – dideli JAV ir ES mažmenininkai reikalauja trečiosios šalies COA patvirtinimo
• Vartotojų grąžinimai ir mokėjimų grąžinimai – kai produktai neatitinka etiketės teiginių
• Žala prekės ženklo reputacijai – vis sunkiau susigrąžinti papildų erdvėje

ES yra tokia pat griežta. Europos maisto saugos tarnyba (EMST) reikalauja, kad teiginio apie sveikatingumą pagrindimas būtų pagrįstas patvirtintais analizės metodais. Kolorimetriniai duomenys neatitinka konkrečių junginių teiginių juostos.

Ko ieškoti tiekėjo bandymų dokumentuose

Kai peržiūrite COA iš abrokolių sėklų ekstraktastiekėjo, tai yra konkreti informacija, nurodanti, ar HPLC iš tikrųjų buvo naudojamas:

• „Tyrimo metodas: HPLC“ – aiškiai nurodyta, nenumanoma
• „Referencinis standartas: gliukorafanas / sulforafanas (sertifikuotas)“ – pavadintas etaloninis junginys, o ne „sinigrino ekvivalentas“
• „Aptikimas: UV 254 nm“ arba „DAD“ arba „MS/MS“ – nurodytas konkretus detektoriaus tipas
• „Stulpelis: C18 atvirkštinė fazė“ – nurodytas stulpelio tipas
• Serijai būdingas partijos numeris – ne bendras pagrindinis COA, pakartotinai naudojamas įvairiose partijose

Jei COA parašyta „Tyrimas: spektrofotometrija“ arba „UV-Vis“ be papildomos informacijos, tai beveik neabejotinai yra kolorimetrinis metodas. Prieš priimdami dokumentą, paprašykite paaiškinimo.

Tiekėjas, turintis tikrą HPLC galimybę, nedvejodamas pateiks visą analizės metodą, standartinio standarto sertifikatą ir neapdorotus chromatogramos duomenis. Toks skaidrumo lygis yra pagrindinis rimtų ingredientų gamintojų standartas.

Ryšys Nrf2 – kodėl tikslūs galios duomenys lemia realius rezultatus

Pagrindinis sulforafano veikimo mechanizmas yra Nrf2 kelio aktyvavimas. Nrf2 (su branduoliniu eritroidiniu 2 faktoriumi susijęs 2 faktorius) yra transkripcijos faktorius, kuris padidina citoprotekcinių fermentų, įskaitant NQO1, HO-1, GST ir GCL, reguliavimą, palaikydamas antioksidacinę apsaugą ir ląstelių detoksikaciją.

Klinikiniuose sulforafano tyrimuose veiksmingumui nustatyti buvo naudojamos tikslios, HPLC patikrintos dozės. Kai tikroji pristatyta dozė skiriasi nuo deklaruotos dozės – nes žaliava buvo pervertinta kolorimetriniu tyrimu – klinikinis rezultatas pasikeičia. Produktas, skirtas tiekti 10 mg sulforafano vienoje porcijoje, iš tikrųjų gali pagaminti 6–7 mg, jei žaliavos stiprumas buvo padidintas. Šis skirtumas yra skirtumas tarp kliniškai reikšmingos dozės ir subterapinės dozės.

Tai nėra teorinis rūpestis. Tai formulavimo realybė, kuri turi įtakos produkto našumui, klientų rezultatams ir pakartotinio pirkimo rodikliams.

Greitų sprendimų sistema pirkėjams

Prieš priimdami bet kokįbrokolių sėklų ekstraktasCOA, atlikite šį kontrolinį sąrašą:

• Ar COA aiškiai nurodyta „HPLC“ kaip tyrimo metodas?
• Ar etaloninis standartas pavadintas (gliukorafanas arba sulforafanas – ne sinigrinas)?
• Ar COA priklauso konkrečiai partijai su unikaliu partijos numeriu?
• Ar tiekėjas gali pateikti neapdorotus chromatogramos duomenis?
• Ar metodas buvo patvirtintas (dokumentuotas tikslumas, tikslumas, tiesiškumas)?
• Ar tiekėjo vidinė laboratorija turi ISO 17025 ar lygiavertę akreditaciją?

Jei atsakymas yra „ne“ arba „nesu tikras“, tai yra jūsų signalas užduoti sunkesnius klausimus arba ieškoti kitur.

Pasitikėkite brokolių sėklų ekstraktu

Jiuyuan Biotech įmonėje kiekviena brokolių sėklų ekstrakto partija yra patikrinta patvirtintu HPLC pagal sertifikuotus gliukorafanino ir sulforafano etaloninius standartus. Mūsų vidinė analitinė laboratorija sukuria konkrečioms partijoms skirtus COA, apimančius tyrimus, sunkiuosius metalus, tirpiklių likučius, mikrobiologiją ir pesticidų likučius – visa tai galima gauti prieš išsiunčiant.

Mūsų brokolių sėklų ekstrakto produktų liniją sudaro:

• Gliukorafaninas, didesnis nei 13 % arba lygus (patikrintas HPLC)
• Sulforafanas didesnis arba lygus 1%, didesnis arba lygus 5%, didesnis arba lygus 10% (patikrinta HPLC)
• Galimi individualūs stiprumo laipsniai pagal užsakymą

Turime 12 tarptautinių sertifikatų, įskaitant ISO 9001, FSSC 22000, cGMP, USDA/EU Organic, Halal ir Kosher. Mūsų ekstraktas buvo minimas 3, 000+ SCI indeksuotuose leidiniuose ir naudojamas 130+ registruotuose klinikiniuose tyrimuose visame pasaulyje.

Jei norite patikrinti mūsų testavimo metodiką, paprašyti mūsų analizės metodo dokumentų arba aptarti formulės reikalavimus, susisiekite tiesiogiai.

📧 Susisiekite su mumis:info@jiuybiotech.com

🌐 Produkto puslapis: Jiuyuan BiotechBrokolių sėklų ekstraktas

Nuorodos

1. Maldini, M., Maksimović, M., Natella, F., Torelli, A. ir Scaccini, C. (2012). HPLC-DAD metodo gliukozinolatams Brassica oleracea veislėse nustatyti sukūrimas ir patvirtinimas. Maisto chemija, 132(4), 2121–2128.
2. Fahey, JW, Wade, KL, Stephenson, KK ir Chou, FE (2003). Gliukozinolatų atskyrimas ir gryninimas iš neapdorotų augalų homogenatų didelės spartos priešsrovės chromatografija. Journal of Chromatography A, 996 (1–2), 85–93.
3. Dinkova-Kostova, AT ir Abramov, AY (2015). Naujas Nrf2 vaidmuo mitochondrijų funkcijoje. Laisvoji radikalioji biologija ir medicina, 88 (B dalis), 179–188.
4. Shapiro, TA, Fahey, JW, Wade, KL, Stephenson, KK ir Talalay, P. (1998). Žmogaus metabolizmas ir kryžmažiedžių daržovių chemoprotekcinių gliukozinolatų ir izotiocianatų išskyrimas. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 7(12), 1091–1100.
5. Vanduchova, A., Anzenbacher, P. ir Anzenbacherova, E. (2019). Izotiocianatas iš brokolių, sulforafanas ir jo savybės. Medicininio maisto žurnalas, 22(2), 121–126.
6. Prestera, T., Holtzclaw, WD, Zhang, Y. ir Talalay, P. (1993). Cheminis ir molekulinis fermentų, detoksikuojančių kancerogenus, reguliavimas. Proceedings of the National Academy of Sciences, 90(7), 2965–2969.